MBTH法检测木聚糖酶活性
MBTH法检测木聚糖酶活性徐丽 王冠 丁皓 程瑛
（武汉新华扬生物股份有限公司，湖北武汉430074）
摘 要：试验采用3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法检测饲料添加剂木聚糖酶和饲料中木聚糖酶的活性，、试验结果表明．MBTH法既可用于检测木聚糖酶制荆的活性，叉可用于饲料中木聚糖酶的检测，但若能更好地降低饲料本身对样品空白值的干扰则更能体现该方法的优势。
木聚糖是植物半纤维素的主要成分，是自然界中仅次于纤维素的可再生资源，主要成分为D一木糖。虽然木聚糖是一类广泛存在于植物体内的半纤维素，但是，由于术聚糖在动物消化道内不能被消化吸收，并且阻碍其它营养成分的消化利用，具有很强的抗营养特性，因而限制了许多饲料的应用。木聚糖酶是一类重要的木糖苷键水解酶酶系，可将木聚糖逐次降解为低聚木糖及木糖，从而消除木聚糖的抗营养作用，提高动物对饲料的利用率。目前检测木聚糖酶最常用的方法为DNS法，但此法灵敏度低，难以满足饲料中微量添加量的检测。3-甲基一2一苯并噻唑酮腙(MBTH)法主要用来测定醛的含量，由于木糖的半缩醛结构具有一定的还原性．MBTH首先与还原糖反应生成嗪，过量的MBTH被Fe3+氧化成阳离子，再与嗪反应生成青蓝色化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈正比例关系。本文根据这一原理检测木聚糖酶的酶活力，旨在验证该方法的可行性。
1材料与方法
1.1试剂与设备
木糖（sigma）、木聚糖(sigma)、木聚糖酶、3-甲基一2一苯并噻唑酮腙(MBTH)、二硫苏糖醇(DTT)、硫酸铁铵、氨基磺酸、乙酸、乙酸钠、氢氧化钠试剂等。
紫外-可见分光光度计（Unico 2800）、水浴摇床（常州国华）、漩涡混合器、电子天平(精确至0.0001 g)、带搅拌的恒温水浴锅（HH-4，常州国
华）、移液器、秒表设备等。
1.2样品
木聚糖酶及饲料样品均采购予市场。
1.3溶液及其配制
50 mM pH值5.5的乙酸一乙酸钠缓冲液：称取三水乙酸钠5.785 g，加入冰乙酸0.425 ml，加水溶解，定容至1000 ml：测定溶液pH值，如果偏离
5.50，再用乙酸或乙酸钠溶液调节至5.50。
MBTH显色液：3 mg／ml的MBTH溶液和1 mg/ml的DTT溶液等量混合即得，现用现配，1 d内有效。
硫酸铁铵试剂：准确称重5.000 g硫酸铁铵(FeNH4(SO4)2-12H2O]和5.000 g氨基磺酸，溶解，转移至1 000 ml容量瓶中，加入36%-38%的浓盐酸41.75 ml，溶解，定容，充分混匀，转移至棕色瓶中，于4℃冰箱贮藏待用。
1 mg/ml木糖标准溶液：精确称取于燥至恒质量的木糖0.100 1 g，用缓冲液定容至100 ml，得1mg/ml的木糖溶液。
1.4制作标准曲线
分别吸取木糖标准溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 ml和2.8 ml．用缓冲液定容至100 ml，配制成浓度为4、8、12、16、20、24、28 μg/ml木糖溶液。
分别取上述各浓度木糖溶液500μl（3组平行样），加入剑500μl0.5 M的NaOH溶液中，再分别加入MBTH试剂500μl，充分混匀，80 ℃水浴加热15 min后，迅速趁热加入硫酸铁铵试剂 1 ml，室温冷却后在650 nm处测定吸光度值。以相应缓冲溶液代替木糖溶液制成空白样。
以木糖浓度为Y轴，吸光值为X轴，得出标准曲线。
1.5反应用酶液的制备
1.5.1饲料中木聚糖酶反应样品的预处理
除按GB/T 14699.1的规定进行采样外，对于
用喷涂方式添加木聚糖酶的颗粒配合饲料，应开
包将颗粒及粉化的料混匀后，按四分法缩分至
200 g，并粉碎通过0.45 nm标准筛，混匀后装入密
封容器内备用。
1.5.2固体样品反应用酶液制备
称取0.5 g样品（颗粒及粉状样品均按1.5.1进行预处理）于150 ml锥形瓶中，精确至0.000 1 g，加人50 ml缓冲液，在回旋式振荡器上提取30min。提取后的试样在离心机上以12 000 r/min离心10 min，取上清液待测。
1.5.3浓体样品的反应用酶液制备
液体样品直接用乙酸一乙酸钠缓冲液进行稀释，定容。
1.6木聚糖酶活力测定
将经预处理的且37℃预热过的0.5 ml酶液和0.5 ml底物溶液(0.8 mg/ml)于试管中混合好后开始计时，于37℃水浴反应30 min，加入1 ml 0.5 M的NaOH溶液，充分混合以终止反应，再分别加入MBTH试剂1 ml，充分混匀，80℃水浴加热15 min后，迅速趁热加入硫酸铁铵试剂2 ml，室温冷却后在650 nm处测定吸光度值，对照标准曲线计算木糖的量。同时以缓冲溶液代替酶溶液检测以作为空白对照。
1.7回收率试验
精确添加一定量木聚糖酶至已知酶活饲料中，按1.6检测酶活，计算回收率。
1.8计算公式
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2结果与分析
2.1MBTH法测木糖标准曲线
MBTH法测木糖标准曲线为y=30.157x-1.037 7，R²=0.999 2(1 cm比色皿);y=56.265 3x+0.051 6,R²=0.999 5（0.5 cm比色皿）。
2.2MBTH法检测木聚糖酶酶活
取不同公司的酶制剂样品，采用MBTH法检测其中木聚糖酶的活性，结果见表1。
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如表1所示，除样品6外，其它样品采用MB-TH法测得的木聚糖酶活性均为标示酶活（国标法）的1/22左右，这可能是由于国标法检测的指标是还原性末端，无论多糖还是单糖，只要具有还原性末端均能发生显色反应，而MBTH则只是检测木糖或者寡糖的含量，因而，MBTH法测得的活性就比国标法要低。但是样品6的木聚糖酶采用MBTH法测得的木聚糖酶活性仅有国标法的1/46左右，说明该酶的酶解反应产物主要是多糖，而木糖和寡糖所占的比例极小，饲料酶需要将多糖分解为单糖和寡糖才有意义，也就是说样品6的木聚糖酶的实际应用效果较差，同样活性的情况下几乎只有其它样品中木聚糖酶效果的50%左右。这可能是由于发酵菌种的不同造成的。综上所述，可以使用MBTH法检测木聚糖酶的活性。
2.3 MBTH法检测饲料中木聚糖酶酶活（见表2）
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如表2所示，对饲料中的木聚糖酶采用MBTH法进行检测，结果发现，与标示添加量的比例在18左右，与单纯检测木聚糖酶活性的结果（22倍）有些出入。为了验证该方法的准确性，做了如下的方法学验证（见表3）。
MBTH法的准确度为103.13%，符合饲料中酶制剂不高于15%的检测误差要求，因此，MBTH法检测饲料中酶制剂的结果是准确可靠的。
2.4 MBTH法检测木聚糖酶酶活（0.5cm比色皿）
由于检测饲料中木聚糖酶时MBTH法的空白吸光值过高，严重干扰了样品的检测，导致实际应用效果不理想；参考专利的办法，将1 cm的比色皿改为0.5 cm的，从而减少其空白吸光值，以减小空白对样品检测的干扰。
取不同公司的木聚糖酶样品，使用0.5 cm比色皿重做MBTH法的标准曲线，采用MBTH法检测木聚糖酶的酶活，结果见表4。
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更换比色皿后，两种方法测得的结果间比例有所不同，使用1 cm比色皿是22倍左右，而使用0.5 cm比色皿则是9倍左右。
再取饲料样品，检测其中的木聚糖酶酶活，见表5。
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结果发现，MBTH法检测饲料中木聚糖酶的结果较稳定，和标示酶活的比例仍是1/9左右。采用0.5 cm比色皿后，检测结果较稳定，与标示酶活相比
木聚糖酶和饲料中木聚糖酶的比例都是1/9左右，但做牺牲了MBTH的检测灵敏度，因为空白吸光值降低的同时样品吸光值也降低了。仍取表5中样品1和样品2，采用MBTH法检测，并在正常检测的基础上增大取样量，以验证其灵敏度（见表6）。
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结果发现，正常检测的情况下，样品1的空白值是0.515，样品吸光值为0.252;当取样量加倍时，空白及样品吸光值都升高了，但空白吸光值增幅更大，从而干扰检测结果，使得检测结果偏低。样品2也得到同样的结果，而目．吸光值偏高，很容易超出线性范围。
3讨论
MBTH法可用来检测醛类物质，也会与半缩醛结构的单糖、寡糖发生反应，结合本试验结果发现，MBTH法确实可检测木聚糖酶的活性，并且其酶活可在一定程度上反映其实际应用效果。但是应用到饲料中木聚糖酶的检测时还存在一定弊端，由于MBTH还可与饲料中的某些还原性物质反应，样品空白对照受到严重干扰，使得检测值偏低，检测限下降。即使采用0.5 cm比色皿对该法进行改进，也不能完全消除这种干扰，因此，此法虽可用，但若能更好地降低空白对照吸光值又不影响样品吸光值，才能体现出该法的优越性。
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